骨髓间充质干细胞移植干预衰老猕猴胸腺结构和

0 引言 Introduction

世界正在经历逐步老龄化的趋势，人口老龄化所带来的衰老相关疾病是中国社会发展面临的巨大挑战。衰老是生物界中普遍存在的现象，主要表现在分子、细胞、组织以及器官水平上一系列功能的退化或丧失[1]。免疫功能衰退是机体衰老的重要机制之一，而胸腺是人体重要的中枢免疫器官，在免疫系统中的作用是不可或缺的。

胸腺是T 细胞分化、发育和成熟的场所，决定着T 细胞免疫应答的有效性。胸腺在胎儿时期发育，在出生后早期达到最大输出；在青年时期和整个成年过程中，随着年龄的增长，胸腺的大小和输出都会表现出下降的趋势[2]。胸腺的萎缩和退化将导致机体免疫力下降，增加老年人患感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的风险，主要表现为胸腺体积变小、细胞结构破坏、脂肪组织填充和初始T 淋巴细胞的输出减少[3]。免疫衰老与胸腺退化密切相关，并以胸腺微环境的增龄性改变为标志[4]。

近年来研究发现，改善胸腺功能有许多治疗方法，如细胞因子治疗[5]、基因疗法[6]、基因敲除技术和生物工程等方法能有效促进胸腺功能的改善与T 细胞再生[7-8]。然而，这些方法也存在一定的风险和挑战，如基因疗法改善胸腺功能后产生新的T 细胞，可能携带一些与患者不兼容的受体，从而导致患者的免疫系统对新的T 细胞产生排斥反应[9]；另外相关的基因敲除技术特异性不高且效率较低，敲除后需进行相关的实验验证，其技术繁杂、造价昂贵[10]；生物工程在短时间内难以实现规模化。以上改善胸腺功能方法的机制尚不明确，而且存在不同程度的缺陷，具体机制有待进一步研究。

近年研究表明，干细胞在再生医学和免疫治疗中的潜力受到广泛关注，其中间充质干细胞是一种来源广泛的具有多向分化潜能的细胞，骨髓来源间充质干细胞是最具特征性的间充质干细胞之一[11]，具有多向分化潜能和自我更新能力。该实验以猕猴为研究对象，探讨骨髓间充质干细胞移植对衰老猕猴胸腺结构和功能的影响。目前国内外已对干细胞改善小鼠胸腺功能进行了一定的探索，但对于骨髓间充质干细胞移植对衰老猕猴胸腺功能改善的机制尚不明确，其治疗效果值得进一步进行探究。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 动物体内实验和随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018 年9 月至2019 年12 月在中国科学院昆明动物研究所和中国人民解放军联勤保障部队第920 医院细胞生物治疗中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 由中国科学院昆明动物研究所提供健康幼年雌猴5 只，平均年龄3 岁，体质量2.0-3.0 kg；健康老年雌猴10 只，平均年龄25 岁，体质量4.0-5.0 kg。所有猕猴均饲养于中国人民解放军联勤保障部队第920 医院动物室内，体型正常，饲养期间环境清洁卫生，动物笼具清洁干燥。所有动物研究经依托单位实验动物伦理委员会批准，批件号为伦审2019-032(科)-01，动物许可证号SYXK(军)2012-0039。

1.3.2 实验主要试剂 恒河猴骨髓间充质干细胞完全培养基(广州Cyagen 公司)；间充质干细胞成脂、成骨和成软骨诱导分化培养基(广州Cyagen 公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco 公司)；抗体CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、IgG1和Cell staining buffer(美国Biolegend 公司)；猴胸腺素α 和猴胸腺生成素ⅡELISA 试剂盒(江苏酶免实业有限公司)。

骨髓间充质干细胞的培养及鉴定细胞来源： 猕猴骨髓原代培养方法： 抽取猕猴骨髓，采用差速贴壁法培养基础培养基： 恒河猴骨髓间充质干细胞完全培养基添加材料： 体积分数为10%胎牛血清和1%青霉素及链霉素原代培养时间： 原代细胞培养1 周后开始换液，之后每两三天换液1 次，培养10-12 d 后开始进行传代细胞传代： 当细胞融合至80%-90%时，使用含0.25%EDTA 的胰酶在室温条件下消化成单细胞悬液进行1 ∶2 传代，每7 d 左右可传1 代，共传3 代细胞鉴定： 流式细胞仪进行骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定和成脂、成骨及成软骨诱导分化能力检测伦理学批准： 实验经过中国人民解放军联勤保障部队第920 医院动物伦理委员会批准

1.3.3 实验仪器 SW-CL-2F 型百万层级层流超净工作台(苏州佳宝净化工程设备公司)；离心机(湖南湘仪公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo 公司)；FACScabilur 流式细胞仪(美国BD 公司)；酶标仪(美国Rayto 公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS 公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 猕猴骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定 幼年猕猴骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养、细胞免疫表型鉴定及多向分化能力鉴定，可参考课题组既往发表的文献[12-13]。倒置相差显微镜下观察细胞的形态和生长状况，待第3 代骨髓间充质干细胞融合达培养瓶底部80%-90%以上时，分别进行骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定和成脂、成骨及成软骨诱导分化能力检测。

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