表达嵌合蛋白转基因番茄疫苗可通过胃肠道吸收

0 引言 Introduction

龋病是危害人类健康的重要疾病之一[1]。根据世界卫生组织的报告，发展中国家约有90%以上的成人及儿童都曾受到龋病的困扰，因此如何防治龋病已成为迫在眉睫的要务。人类致龋最主要的致病菌变异链球菌(S.mutans)迅速黏附并定植于牙面，是引起龋病的首要条件[2]。PAc菌体表面蛋白是变异链球菌主要的毒力因子和黏结素，介导菌体与牙面最初的蔗糖非依赖性黏附，其A区(PAcA)具有免疫原性[3]。而霍乱毒素B亚单位(CTB)作为一种无毒的免疫佐剂与其联合免疫(PAcA/CTB)，既可避免单独应用天然多肽抗原免疫原性较差缺点，又可以激发宿主产生持续不断的免疫效果。近年来，转基因植物防龋疫苗因其使用方便，价格低廉，易于生产、运输和储存等优势得以迅速发展[4]。

国内外大量研究发现以转基因植物作为抗原能够有效激发动物的黏膜免疫应答和体液免疫应答。GOLDVKIN等[5]报道利用表达牛痘病毒B5衣壳蛋白的转基因烟草疫苗免疫小鼠，可诱导其发生黏膜免疫应答反应并产生强烈的抗牛痘病毒免疫反应。SALYAEV等[6]将高危型人乳头瘤病毒HPV 16 L1导入番茄中获得转基因番茄疫苗喂养小鼠，于免疫后第4天血清中出现免疫应答反应，并持续表达高抗体水平达100 d。TAKASHIMA等[7]用转基因烟草和胡萝卜中表达转麻疹病毒 H 蛋白，在已经免疫过的小鼠和志愿者身上进行了免疫加强试验，均产生了极强的免疫应答反应。作者所在课题组前期用转基因番茄口服免疫小鼠、大鼠、兔动物实验观察到唾液及血液中均有特异性抗体产生[8-10]。文章将对表达嵌合蛋白PAcA/CTB的转基因疫苗的免疫原性以及抗龋效果进行分析。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9月至2018年7月在遵义医学院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 免疫材料 表达PAcA/CTB嵌合蛋白的转基因番茄果实(作者所在课题组育培)；非转基因番茄果实(市售)；UA159变异链球菌灭活全菌疫苗(作者所在课题组制备)。

1.3.2 实验动物及菌株 18 d龄雄性SD大鼠18只，选购自第三军医大动物实验室。许可证编号及质检单位：SCXK (渝)，重庆市实验动物质检中心。变异链球菌(UA159，血清C型)来源于四川大学华西口腔医学院国家重点实验室。

1.3.3 主要试剂及设备 变异链球菌表面蛋白抗原PAc(樊明文课题组前期制备)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Amresco公司，美国)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgA( Genetex公司，美国)；体视显微镜(奥林巴斯公司，日本)；酶联免疫检测仪 (型号ELx800，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 细菌培育 先后接种变异链球菌菌种于BHI液体培养基中培育；MSB琼脂固体培养基培育；取单菌落于BHI液体培养基中培育(培育条件为体积分数2.5%CO2，95%N，37 ℃，培育时间48 h)。将细菌浓度调整为1× 1012CFu/L，备用。

1.4.2 转基因植物蛋白的提取与目标蛋白含量检测 取转基因番茄果肉1g，加液氮研磨成粉末状，依次加入植物蛋白提取液3.5 mL，15%(G)的PVP-40冰上静置4 h；离心15 min (14 000 r/min)，取上清液煮沸5 min，分装备用。用 ELISA法包被目的蛋白PAcA/CTB，依次加入一抗(抗PAc抗体)，二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)及终止液。并于酶标仪上记录波长490 nm处的样本A值。

1.4.3 动物实验分组 18只18 d龄的雄性SD大鼠随机分为3组，每组6只。①阳性对照组：喂食灭活全菌疫苗；②实验组：喂食转基因番茄汁；③阴性对照组：喂食普通番茄汁。

1.4.4 建立龋齿动物模型 连续3 d喂食20 d龄的SD大鼠致龋饲料2000#(Navia 1997)(表1)，致龋饲料中含有含量为1 g/kg的羧苄青霉素、氨苄青霉素、氯霉素。连续3 d给24 d龄的SD大鼠于牙面上接种变异链球菌(1×1012CFU/L)，200 μL/次，3次/d，于接种细菌前后检测口腔变异链菌感染情况。

表1 ｜致龋饲料2000# 配方表Table 1 ｜Formula of caries-causing feed 2000#成分 构成百分比 (%) 全麦粉 6蔗糖 56精炼奶粉 28精炼豆粉 4酵母 4食用盐 2 实验动物造模过程的相关问题造模目的： 用含PAcA/CTB的转基因番茄以灌胃的方式免疫SD大鼠，观察其免疫反应性及免疫原性借鉴已有标准实施动物造模：建立龋齿动物模型动物来源及品系： 雄性SD大鼠选购自第三军医大动物实验室模型与所研究疾病的关系：该课题组前期用转基因番茄口服免疫小鼠、大鼠、兔动物实验观察到唾液及血液中均有特异性抗体产生造模技术描述： 连续3 d喂食20 d龄的SD大鼠致龋饲料2000#(Navia 1997)，致龋饲料中含有含量为1 g/kg的羧苄青霉素、氨苄青霉素、氯霉素。连续3 d给24 d龄的SD大鼠于牙面上接种变异链球菌(1×1012CFU/L)，200 μL/次，3次/d，于接种细菌前后检测口腔变异链菌感染情况造模主要诱导用药：1 g/kg的羧苄青霉素、氨苄青霉素、氯霉素；变异链球菌动物数量及分组方法：18只雄性SD大鼠随机分为3组，每组6只。①阳性对照组：喂食灭活全菌疫苗；②实验组：喂食转基因番茄汁；③阴性对照组：喂食普通番茄汁造模后实验观察指标：①转基因番茄中目的蛋白含量；②唾液中sIgA型抗PAcA抗体水平；③血液中IgG型抗PAcA抗体水平；④大鼠磨牙龋齿Keyes评分造模后动物处理： 免疫前及免疫1，2，3，4周取血、唾液；鼠龄57 d时，麻醉处死大鼠，取上下颌骨标本，检测相关指标伦理委员会批准： 实验方案经遵义医学院动物实验伦理委员会批准

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