骨性关节炎差异表达谱及竞争性内源调控的网络

0 引言 Introduction

骨性关节炎是由多种因素导致关节软骨的非炎症性退行性变及关节边缘骨赘形成，是一种常见的骨关节病变，多在老年人中出现，骨性关节炎的发病率较高，且病因尚不明确[1]，当今中国正逐渐步入老龄化社会，其患病率逐年上升。骨性关节炎已成为全世界中老年健康的严重威胁，这一公共卫生问题受到全球的广泛关注[2]。临床上西医治疗骨性关节炎多采用药物治疗，包括非类固醇类镇痛消炎药、透明质酸钠和氨基葡萄糖等，但只能缓解症状，而且有些药物还有一定的不良反应[3]。从临床治疗效果来看，目前针对骨性关节炎的药物仅仅局限于缓解及改善症状，却不能起到真正逆转和治愈的效果，此外，由于发生骨性关节炎的过程交错复杂，众多因素分子参与其中，目前难以发现有效的生物预测因子，使得上述治疗方法所使用的药物靶向性均不强。因此，深入理解骨性关节炎发生发展过程中的分子机制，探究潜在的治疗靶点，对于阐述其治病的科学性具有重要的意义。

目前研究证实，miRNA 在骨性关节炎发病机制中起重要作用，可直接或间接调控软骨细胞表达，防止骨性关节炎退行性病变[4]，lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 调控网络与类风湿性关节炎、肝癌、肺癌、帕金森病和膀胱癌的发生密切相关[5-7]。然而，关于骨性关节炎的类似研究仍较缺乏。

实验通过生物信息学方法分析骨性关节炎发生相关差异表达基因，构建起长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)和mRNA 之间的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)调控网络，并结合GeneMANIA 和FUNRICH 进行相关功能分析，为探索骨性关节炎的发病机制提供了理论依据。

1 资料和方法 Data and methods

1.1 设计 生物信息大数据整合分析。

1.2 时间及地点 于2019 年11 月至2020 年1 月在山东中医药大学附属医院实验室完成。

1.3 数据资料收集 在高通量基因表达(Gene Expression Omnibus，GEO) 数 据 库( Homo sapiens”，检索时间范围在2009 年1 月至2019 年12 月。从检索结果中筛选软骨标本，根据检索结果从GEO 数据库下载芯片GSE(平台GPL，Agilent-0 探针，全人类基因组芯片4x44K v2 )和GSE(平台GPL570，Affymetrix人类基因组阵列 U133 Plus 2.0)[8-9]。数据集中纳入了58 份样本，其中13 份为人正常膝关节软骨样本，45 份为人骨性关节炎软骨样本，下载芯片中矩阵及平台文件。

1.4 方法

1.4.1 差异表达基因筛选 运用R 语言(版本3.6.2)软件RStudio(版本1.2.5033)的Limma 包对GEO 数据库下载的芯片进行差异基因的分析，以logFC(log2 fold change，log2 差异倍数) ＞1 或者＜ -1，并且校正后P＜ 0.05 为筛选参数，筛选出骨性关节炎软骨组织和正常组织中差异表达的mRNA，绘制差异表达的mRNA 的热图和火山图。将芯片的差异表达mRNA 取交集，logFC 大于0 代表此差异mRNA 在骨性关节炎中上调，反之则为下调。

1.4.2 预测mRNA 结合的miRNA 根据StarBase 数据库( 数 据 库( 和miRDB 数 据库 ( 的miRNA[10-12]。miRDB 数据库是一个用于miRNA 目标预测和功能注释的在线数据库，其所有靶点都是通过对数千个miRNA-靶点相互作用(miRNA-target interactions，MTI)的高通量测序实验的分析而开发出来的。miRTarBase 数据库是一个积累了36 万多个经过实验验证的microRNA-mRNA 靶向关系的数据库，其数据构建主要通过手工检索相关文献并系统地挖掘文本来筛选与miRNA 功能研究相关的研究文章获得。starBase v3.0 是一个开放源码平台，其从多维测序数据中识别出超过110 万miRNA-ncRNA，250 万miRNA-mRNA，210 万RBP-RNA 和150万RBP-RNA 相互作用。

上述3 个数据库中至少2 个数据库预测得到的miRNA 才纳入研究，以构建miRNA-mRNA 调控网络。

1.4.3 预测lncRNA 结合的miRNA 在LncRNADisease 数据库( 数据库( 关联，以构建骨性关节炎可能的lncRNA 相关的ceRNA 网络，研究骨性关节炎可能的发病机制。

1.4.4 ceRNA 调控网络的构建 运用Cytoscape 软件(版本3.7.1)分别构建miRNA-mRNA和IncRNA-miRNA调控关系网络，运用merge 功能得到IncRNA-miRNA-mRNA 的ceRNA 网络，连线代表节点之间存在调控关系。运用Cytoscape 软件中的GeneMANIA 插件预测与差异mRNA 共表达的基因[14]，构建网络。使用FUNRICH 分析差异mRNA 生物学过程和通路。

1.5 主要观察指标 检测的差异表达mRNA 及生物学过程，ceRNA 构建情况。

1.6 统计学分析 实验运用R 软件(版本3.6.2)的limma 包分析系列矩阵文件中的差异基因，以logFC(log2 fold change，log2 差异倍数) ＞1 或者＜ -1，并且校正后P＜ 0.05 为筛选参数。

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