生物学论文_非洲猪瘟病毒p72和CD2v双基因实时

文章目录

1 材料与方法

1.1 材料

    1.1.1 标准品

    1.1.2 非洲猪瘟病毒株

    1.1.3 疫苗株

    1.1.4 主要试剂

    1.1.5 主要仪器

1.2 方法

    1.2.1 病毒核酸的提取

    1.2.2 引物和探针的设计合成

    1.2.3 非洲猪瘟病毒B646L(p72)和EP402R(CD2v)阳性质粒构建

    1.2.4 双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

        1.2.4.1 p72单次荧光定量PCR反应条件的优化

        1.2.4.2 CD2v单次荧光定量PCR反应条件的优化

        1.2.4.3 p72-CD2v双重荧光定量PCR反应条件的优化

        1.2.4.4 标准曲线建立

        1.2.4.5 最低检出限

        1.2.4.6 重复性和特异性

        1.2.4.7 临床样本检测

2 结果

2.1 非洲猪瘟病毒B646L(p72)和EP402R(CD2v)阳性质粒构建

2.2 p72基因荧光定量PCR反应条件的优化

2.3 CD2v基因荧光定量PCR反应条件的优化

2.4 p72、CD2v基因双重荧光定量PCR反应条件的优化

2.5 标准曲线建立

2.6 最低检出限

2.7 重复性试验

2.8 特异性试验

2.9 临床样本

3 讨论

文章摘要:为了建立一种快速、准确、敏感的非洲猪瘟病毒p72和CD2v基因双重荧光定量PCR方法,根据GenBank公布的ASFV基因序列,针对p72基因保守区域和CD2v基因保守区域分别设计特异性引物和探针,并且对反应条件进行了优化。结果显示,该方法对ASFV p72、CD2v基因呈现特异性扩增,对猪瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪肺炎支原体均无扩增。建立的方法可检出低至7.3copies/μL～24.5 copies/μL的ASFV核酸。用建立的方法检测2017年以前保存的105份来自国内猪场的血清和组织样本,105份样品均无ASFV核酸扩增。用该方法检测5份ASFV灭活参考样品,符合率为100%。说明建立的方法快速、敏感、准确,可用于ASFV的分子诊断和监测。

文章关键词:

论文DOI:10.16437/j.cnki.1007-5038.2021.11.008

论文分类号:S852.65

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