生物学论文_猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK29

文章目录

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 重组慢病毒表达载体的构建

1.3 重组慢病毒包装

1.4 重组细胞的构建和鉴定

1.5 重组蛋白的纯化

1.6 亚单位疫苗制备和免疫原性分析

1.7 ELISA检测小鼠血清中的E2特异性抗体

2 结 果

2.1 目的基因克隆

2.2 重组质粒pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF的双酶切鉴定

2.3 HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF重组细胞鉴定

2.4 重组蛋白的ELISA和Western blotting鉴定

2.5 重组蛋白纯化

2.6 小鼠血清E2特异性抗体检测

3 讨 论

4 结 论

文章摘要:【目的】设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性,为猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH,将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒,转导HEK293T细胞,经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定,得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段,表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体;细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带,表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组;Western blotting分析获得约70 ku的条带,证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达;SDS-PAGE验证显示,纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带,纯度较高,大小约70 ku;小鼠免疫血清ELISA检测结果表明,表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性,免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体,免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900,免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100,远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白,为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗,同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。

文章关键词:

作者单位: 

论文DOI:10.16431/j.cnki.1671-7236.2022.02.029

论文分类号:S852.651

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